一,基本原理
二,應(yīng)用范圍
三,儀器結(jié)構(gòu)
一,基本原理
利用紫外－可見吸收光譜來進行定量分析由來已久，可追溯到古代，公元60年古希臘已經(jīng)知道利用五味子浸液來估計醋中鐵的含量，這一古老的方法由于zui初是運用人眼來進行檢測，所以又稱比色法。到了16、17世紀(jì)，相關(guān)分析理論開始蓬勃發(fā)展，1852年，比爾（Beer）參考了布給爾（Bouguer）1729年和朗伯（Lambert）在1760年所發(fā)表的文章，提出了分光光度的基本定律，即液層厚度相等時，顏色的強度與呈色溶液的濃度成比例，從而奠定了分光光度法的理論基礎(chǔ)，這就是的朗伯－比爾定律。
1．紫外－可見吸收光譜的形成
吸光光度法也稱做分光光度法，但是分光光度法的概念有些含糊，分光光度是指儀器的功能，即儀器進行分光并用光度法測定，這類儀器包括了分光光度計與原子吸收光譜儀（AAS）。吸光光度法的本質(zhì)是光的吸收，因此稱吸光光度法比較合理，當(dāng)然，稱分子吸光光度法是zui確切的。
紫外－可見吸收光譜是物質(zhì)中分子吸收200-800nm光譜區(qū)內(nèi)的光而產(chǎn)生的。這種分子吸收光譜產(chǎn)生于價電子和分子軌道上的電子在電子能級躍遷（原子或分子中的電子，總是處在某一種運動狀態(tài)之中。每一種狀態(tài)都具有一定的能量，屬于一定的能級。這些電子由于各種原因（如受光、熱、電的激發(fā)）而從一個能級轉(zhuǎn)到另一個能級，稱為躍遷。）當(dāng)這些電子吸收了外來輻射的能量就從一個能量較低的能級躍遷到一個能量較高的能級。因此，每一躍遷都對應(yīng)著吸收一定的能量輻射。具有不同分子結(jié)構(gòu)的各種物質(zhì)，有對電磁輻射顯示選擇吸收的特性。吸光光度法就是基于這種物質(zhì)對電磁輻射的選擇性吸收的特性而建立起來的，它屬于分子吸收光譜。躍遷所吸收的能量符合波爾條件：
二,應(yīng)用范圍
紫外－可見分光光度計可用于物質(zhì)的定量分析、結(jié)構(gòu)分析和定量分析。而且還能測定某些化合物的物理化學(xué)參數(shù)，如摩爾質(zhì)量、配合物的配合比例和穩(wěn)定常熟、酸堿電離常數(shù)等。
1．定性分析
緊外－可見分光光度法對無機元素的定性分析應(yīng)用較少，無機元素的定性分析可用原子發(fā)射光譜法或化學(xué)分析的方法。在有機化合物的定性鑒定和結(jié)構(gòu)分析中，由于紫外－可見光譜較簡單，特征性不強，因此該法的應(yīng)用也有一定的局限性。但是它適用于不飽和有機化合物。尤其是共軛體系的鑒定，以此推斷未知物的骨架結(jié)構(gòu)。此外，可配合紅外光譜、核磁共振波譜法和質(zhì)譜法進行定性鑒定和結(jié)構(gòu)分析，因此它仍不失為是一種有用的輔助方法。
一般有兩種定性分析方法，比較吸收光譜曲線和用經(jīng)驗規(guī)則計算zui大吸收波長λmax，然后與實測值進行比較。
2．結(jié)構(gòu)分析
結(jié)構(gòu)分析可用來確定化合物的構(gòu)型和構(gòu)象。如辨別順反異構(gòu)體和互變異構(gòu)體。
3．定量分析
紫外－可見分光光度定量分析的依據(jù)是Lambert-Beer定律，即在一定波長處被測定物質(zhì)的吸光度與它的溶度呈線性關(guān)系。應(yīng)此，通過測定溶液對一定波長入射光的吸光度可求出該物質(zhì)在溶液中的濃度和含量。種常用的測定方法有：單組分定量法、多組分定量法、雙波長法、示差分光光度法和導(dǎo)數(shù)光譜法等。
4．配合物組成及其穩(wěn)定常數(shù)的測定
測量配合物組成的常用方法有兩種：摩爾比法（又稱飽和法）和等摩爾連續(xù)變化法（又稱Job法）。
5．酸堿離解常數(shù)的測定
光度法是測定分析化學(xué)中應(yīng)用的指示劑或顯色劑離解常數(shù)的常用方法，該法特別適用于溶解度較小的弱酸或弱堿。
三,儀器結(jié)構(gòu)
1.紫外－可見分光光度計的主要部件
*的紫外－可見分光光度計生產(chǎn)廠家有上百家，產(chǎn)品型號成千上萬，但就基本結(jié)構(gòu)來說，都是由五個部分組成，即光源、單色器（單色儀）、吸收池、檢測器和信號指示系統(tǒng)。如下圖所示：
光源
對光源的基本要求是：應(yīng)在儀器操作所需的光譜區(qū)域內(nèi)能夠發(fā)射連續(xù)輻射；有足夠的輻射強度和良好的穩(wěn)定性，而且輻射能量隨波長的變化應(yīng)盡可能小。紫外－可見分光光度計中常用的光源有熱輻射光源和氣體放電光源兩類。熱輻射光源用于可見光區(qū)。如鎢絲燈和鹵鎢燈；氣體放電光掉用于紫外光區(qū)，如氫燈和氘燈。
鎢燈和碘鎢燈可使用的范圍在340～2500nm，這類光源的輻射能量與施加的外加電壓有關(guān)，在可見光區(qū)，輻射的能量與工作電壓的4 次方成正比。光電流也與燈絲電壓的n次方（n>l）成正比。因此必須嚴(yán)格控制燈絲電壓，儀器必須備有穩(wěn)壓裝置。
在近紫外區(qū)測定時常用氫燈和氘燈，它們可在160～375nm 范圍內(nèi)產(chǎn)生連續(xù)光源。氘燈的燈管內(nèi)充有氫的同位素氘，它是紫外光區(qū)應(yīng)用zui廣泛的一種光源，其光譜分布與氫燈類似，但光強度比相同功率的氫燈要大3～5 倍。
單色器
單色器是能從光源輻射的復(fù)合光中分出單色光的光學(xué)裝置，其主要功能應(yīng)該是能夠產(chǎn)生光譜純度高且波長在紫外可見區(qū)域內(nèi)任意可調(diào)的單色光。單色器一般由入射狹縫、準(zhǔn)直鏡（透鏡或凹面反射鏡使入射光成平行光）、色散元件、聚焦元件和出射狹縫等幾部分組成。其核心部分是色教元件，起分光的作用。單色器的性能直接影響人射光的單色性，從而也影響到測定的靈敏度、選擇性及校準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系等。
能起分光作用的色散元件主要是棱鏡和光柵。棱鏡常用的材料有玻璃和石英兩種。它們的色散原理是依據(jù)不同波長光通過棱鏡時有不同的折射率而將不同波長的光分開。由于玻璃可吸收紫外光，所以玻璃棱鏡只能用于350～3200 nm 的波長范圍，即只能用于可見光區(qū)域內(nèi)。石英棱鏡適用的波長范圍較寬，可從185～4000nm，即可用于紫外、可見、近紅外三個光域。
光柵是利用光的衍射與干涉原理制成的。它可用于紫外、可見及近紅外光域，而且在整個波長區(qū)具有良好的、幾乎均勻一致的分辨能力。它具有色散波長范圍寬、分辨本領(lǐng)高、成本低、便于保存和易于制備等優(yōu)點。缺點是各級光譜會重疊而產(chǎn)生干擾。
入射、出射狹縫，透鏡及準(zhǔn)直鏡等光學(xué)元件中狹縫在決定單色器性能上起重要作用。狹縫的大小直接影響單色光純度，但過小的狹縫又會減弱光強。
吸收池
吸收池用于盛放分析試樣，一般有石英和玻璃材料兩種。石英池適用于可見光區(qū)及紫外光區(qū)，玻璃吸收池只能用于可見光區(qū)。為減少光的反射損失，吸收池的光學(xué)面必須*垂直于光束方向．在高精度的分析測定中（紫外區(qū)尤其重要）,吸收池要挑選配對。因為吸收池材料的本身吸光特征以及吸收池的光程長度的精度等對分析結(jié)果都有影響。
檢測器
檢測器的功能是檢測光信號、測量單色光透過溶液后光強度變化的一種裝置，常用的檢測器有光電池、光電管和光電倍增管等。它們通過光電效應(yīng)將照射到檢測器上的光信號轉(zhuǎn)變成電信號。對檢測器的要求是：在測定的光譜范圍內(nèi)具有高的靈敏度；對輻射能量的響應(yīng)時間短，線性關(guān)系好；對不同彼長的輻射響應(yīng)均相同，且可靠；噪音低，穩(wěn)定性好等。
硒光電池對光的敏感范圍為300～800nm ，其中又以500～600nm zui為靈敏。這種光電池的特點是能產(chǎn)生可直接推動微安表或檢流計的光電流，但由于容易出現(xiàn)疲勞效應(yīng)而只能用于低檔的分光光度計中。
光電管在紫外－可見分光光度計上應(yīng)用較為廣泛。它的結(jié)構(gòu)是以一彎成半圓柱形的金屬片為陰極，陰極的內(nèi)表面涂有光敏層，在圓柱形的中心置一金屬絲為陽極．接受陰極釋放出的電子。兩電極密封于玻璃或石英管內(nèi)并抽成真空。陰極上光敏材料不同，光譜的靈敏區(qū)也不同。可分為藍敏和紅敏兩種光電管，前者是在鎳陰極表面上沉積銻和艷，可用于波長范困為210～625 nm；后者是在陰極表面上沉積了銀和氧化艷。可用范圍為625～1000nm。與光電池比較，它有靈敏度高、光敏范圍寬、不易疲勞等優(yōu)點。
光電倍增管是檢測微弱光zui常用的光電元件，它的靈敏度比一般的光電管要高200 倍，因此可使用較窄的單色器狹縫，從而對光譜的精細結(jié)構(gòu)有較好的分辨能力。
信號指示系統(tǒng)
它的作用是放大信號并以適當(dāng)方式指示或記錄下來。早期常用的信號指示裝置有直讀檢流計、電位調(diào)節(jié)指零裝置以及數(shù)字顯示或自動紀(jì)錄裝置等。現(xiàn)在很多型號的分光光度計都可配套計算機使用，一方面可對分光光度計進行操作控制，另一方面可進行數(shù)據(jù)處埋。
2．紫外－可見分光光度計的分類
紫外－可見分光光度計的類型很多，但可歸納為三種類型：單光束分光光度計、雙光束分光光度計和雙波長分光光度計。
單光束分光光度計
其光路示意圖如前圖（紫外－可見分光光度計的基本結(jié)構(gòu)圖）所示，經(jīng)單色器分光后的一束平行光，輪流通過參比溶液和樣品溶掖，以進行吸光度的測定。這種類型的分光光度計結(jié)構(gòu)簡單，操作方便，維修容易，適用于常規(guī)分析。國產(chǎn)722型，751型、724型、英國SP500型以及Backman DU－8 型等均屬于此類光度計。
雙光束分光光度計
其光路示意如下圖所示，經(jīng)單色器分光后經(jīng)反射鏡（M1）分解為弧度相等的兩束光，一束通過參比池，另一束通過樣品池。光度計能自動比較兩束光的強度，此比值即為試樣的透射比，經(jīng)對數(shù)變換將它轉(zhuǎn)換成吸光度并作為波長的函數(shù)記錄下來。雙光束分光光度計一般都能自動記錄吸收光譜曲線。由于兩束光同時分別通過參比池和樣品他，還能自動消除光源強度變化所引起的誤差。這類儀器有國產(chǎn)710 型、730型和740型，日立220系列，島津－210，英國UNICAM SP－700等等。
雙波長分光光度計
其基本光路如下圖所示。由同一光源發(fā)出的光被分成兩束，分別經(jīng)過兩個單色器，得到兩束不同波長的單色光；再利用切光器使兩束光以一定的頻率交替照射同一吸收池，然后經(jīng)過光電倍增管和電子控制系統(tǒng)，zui后由顯示器顯示出兩個波長處的吸光度差值ΔA （ΔA = A1-A2）。
雙波長分光光度計的優(yōu)點：對于多組分混合物、混濁試樣（如生物組織液）的分析，以及存在背景于擾或共存組分吸收干擾的情況下，利用雙波長分光光度法，往往能提高方法的靈敏度和選擇性。利用雙波長分光光度計，能獲得導(dǎo)數(shù)光譜。通過光學(xué)系統(tǒng)轉(zhuǎn)換，使雙波長分光光度計能很方便地轉(zhuǎn)化為單波長工作方式。如果能在兩波長處分別記錄吸光度隨時間變化的曲線，還能進行化學(xué)反應(yīng)動力學(xué)研究。
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